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真武汤配方颗粒化学成分研究2020-04-21

真武汤配方颗粒化学成分研究
真武汤出自《伤寒论》,药物组成为:茯苓三钱9g芍药三钱9g白术二钱6g生姜三钱9g附子炮去皮
,一枚,破八片9g。具有温阳利水的功效,主治脾肾阳虚,水气内停证。小便不利,四肢沉重疼痛,
腹痛下利,或肢体浮肿,苔白不渴,脉沉;太阳病发汗过多,阳虚水泛。汗出不解,其人仍发热,
心下悸,头眩,身瞤动,振振欲擗地。过量服用会有毒性反应,临床中偶有口干、便结,孕妇忌服。
本次实验以高效液相色谱法,对真武汤配方颗粒中的有效成分进行定性然后定量。本实验旨在为
真武汤配方颗粒的质量标准建立提供参考。
 
1. 材料
1.1仪器+辅助工具
    waters 2695型HPLC仪,包括2966二极管阵列检测器、Empower3色谱工作站;赛多利斯万分之
一天平(赛多利斯科学仪器有限公司);0.45μm滤头,注射器(匹配0.45μm滤头),500ml烧杯,
玻璃搅拌棒,容量瓶。
1.2药品与试剂
    对照品:5-羟甲基糠醛,没食子酸,芍药内酯苷,芍药苷,苯甲酸,苯甲酰新乌头原碱,苯甲酰
乌头原碱,6-姜酚,白术内酯III,均购买于成都埃法生物科技有限公司,采用面积归一化法检测纯
度均大于98%。乙腈为色谱纯,三乙胺,磷酸,均为分析纯,水为怡宝纯净水(4.5L)。
 1.3原料
一方制药-中药配方颗粒一剂包括:生姜3包(0.5g/包),茯苓1包(0.5g/包),麸炒白术1包
(3.0g/包),白芍1包(1.0g/包),淡附片配方颗粒(0.7g/包)。(相当于临床使用药材生姜9g,
茯苓10g,麸炒白术10g,白芍10g,淡附片6g)
 
2. 方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱:月旭C18色谱柱 4.5mm*250mm*5μm;流动相:A:乙腈,B:0.1%磷酸水+0.1%三乙胺水,
(梯度洗脱:0-5min,A:5%,5-25min,A:5%-17%,25-70min,A:17%-65%,70-75min,
A:65%,75-76min,A:65%-90%,76-90min,A:90%,90-92min,A:90%-5%,92-100min,A:5%)。
检测波长(定量用波长):5-羟甲基糠醛,没食子酸,6-姜酚均用280nm;芍药苷,芍药内酯苷,苯甲酸,
苯甲酰新乌头碱,苯甲酰乌头原碱,均用230nm;白术内酯III用222nm。柱温:35℃,流速:1.0mlmin。
 
2.2真武汤的制备
  取真武汤配方颗粒一剂,500ml烧杯一个,将一剂药中每个小袋撕开倒入烧杯中,先加50ml沸水湿润,
再加200ml沸水搅拌使颗粒溶化,放冷,过00.45μm针头滤器,即得。
 
 2.3溶液配制
分别取,对照品没食子酸,5-羟甲基糠醛,芍药内酯苷,芍药苷,苯甲酸,苯甲酰新乌头原碱,苯甲酰乌头原碱,
6-姜酚,白术内酯III(均购买于成都埃法生物),配制成浓度分别为0.14μg/μl, 0.044μg/μl, 0.056μg/μl
,0.164μg/μl,0.032μg/μl,0.012μg/μl, 0.002μg/μl,0.036μg/μl,0.00096μg/μl的混合对照液。
 
2.4系统适用性试验
精密量取“2.3”项下混合对照品溶液适量,按“2.1”项下色谱条件进样测定,
记录色谱图。由图1可知,在该色谱条件下, 各成分均能达到基线分离。


标记时间的峰依次分别为:没食子酸,5-羟甲基糠醛,芍药内酯苷,芍药苷,苯甲酸,苯甲酰新乌头原碱,苯甲酰乌头原碱,6-姜酚,
白术内酯III)
2.5标准曲线绘制
 
没食子酸:Y=446763x-77438   (R=1,n=5)
5-羟甲基糠醛:Y=291453x-64474  (R=1,n=5)
 
芍药内酯苷:Y=82741x-12477  (R=0.9997,n=5)
 
芍药苷:Y=306544x-474523  (R=0.999,n=5)
 
苯甲酸:Y=230965x-83997  (R=1,n=5)
 
苯甲酰新乌头原碱:Y=35628x-493.81(R=0.9998,n=5)
 
苯甲酰乌头原碱:Y=4611.4x+1409  (R=0.999,n=5)
 
6-姜酚:Y=24491x-5201.6 (R=0.9999,n=5)
 
白术内酯III :Y=2148x+2907.1 (R=0.9994,n=5)
2.6重复性试验
9种物质保留时间RSD, n=5,
没食子酸RSD=1.84%,5-羟甲基糠醛RSD=1.40%,芍药内酯苷RSD=0.36%,芍药苷RSD=0.29%,苯甲酸RSD=0.22%,
苯甲酰新乌头原碱RSD=0.09%,苯甲酰乌头原碱RSD=0.09%,6-姜酚RSD=0.07%,白术内酯IIIRSD=0.05%,表明仪器重现性良好。
2.7样品含量计算
  标准方程 相关度 真武汤进样 100μl 峰面积 计算X(体积 μL) 进样浓度(μg/μl) 进样质量μg 含量 μg/ml
没食子酸    Y=446763x-77438 1 14353017 32.3 0.14 4.522 45.22
5-羟甲基糠醛     Y=291453x-64474 1 4827751 16.79 0.044 0.739 7.39
芍药内酯苷       Y=82741x-12477 0.9997 9925475 120.11 0.056 6.726 67.26
芍药苷           Y=306544x-474523 0.999 31523969 104.38 0.164 17.118 171.18
苯甲酸           Y=230965x-83997 1 6243645 27.4 0.032 0.877 8.77
苯甲酰新乌头原碱230 Y=35628x-493.81 0.9998 969149 26.47 0.012 0.318 3.18
苯甲酰乌头原碱  230 Y=4611.4x+1409 0.999 704830 152.54 0.002 0.305 3.05
6-姜酚           Y=24491x-5201.6 0.9999 88901 3.84 0.036 0.138 1.38
白术内酯III        Y=2148x+2907.1 0.9994 88769 39.97 0.00096 0.038 0.38

3讨论
有研究认为,同时测定中药复方中多个成分时,因 各成分的紫外最大吸收波长不同,因此需要采用波长切
换法测定各成分的含量。参考文献在 190~400 nm 波长范围内对 9 种待测成分进行全波长扫描,结果发现,
在233 nm波长处芍药苷,芍药内酯苷,苯甲酸,苯甲酰乌头原碱,苯甲酰新乌头原碱,有较大吸收,
222 nm波长处白术内酯III有最大吸收,280nm波长处5- 羟甲基糠醛,,有最大吸收,205nm,
272nm处没食子酸有最大吸收,200nm,281nm处6-姜酚有最大吸收,考虑到部分成分含量较低,
因此在保证各待测成分检测灵敏度及基线分离的情况下,本研究采用“2.1”项下波长作为检测波长。
综上所述,本研究所建定性(保留时间+紫外光谱比对)定量方法准确、专属性好,可用于同时测定
真武汤中9种活性成分的含量。
附 标准曲线图+紫外光谱图








 

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